質譜技術的快速發展和應用有目共睹。學物理出身、從事科學研究的質譜學者會做出什么樣的選擇？數年前在北京質譜年會上，第一次聽聶宗秀的報告時就印象深刻，用離子阱質譜測定數百兆分子量的大顆粒的工作讓人耳目一新。如果說探索高質量極限的工作還不夠引人注意，那么用MALDI測定那些以前不能測定的納米顆粒，最終對生物組織內的納米顆粒進行成像的工作，則得到大家的認可，該工作不僅發表在Nature Nanotech.上，而且由雜志社撰文在同期的“新聞視角”中進行了專欄評論，被Chem. Res. Toxicol.選為“研究亮點”，入選2016年Nature Nanotech.雜志10周年專刊。同時，該工作也是中國學者發表的比較有影響的質譜成像工作之一。不久前，采訪了中科院化學所聶宗秀研究員，他詳解了自己在探索質譜測定超大分子、小分子兩端極限的工作，以及前沿的MALDI質譜成像工作，希望對所有關注質譜及其應用的讀者有啟發……
探索質譜兩極限：生物分子大顆粒質譜和MALDI高通量分析小分子
聶宗秀研究員首先簡介了自己的主要研究工作：用于分析超大分子量顆粒的離子阱質譜；MALDI質譜及質譜成像的研究。
2005-2007年，在臺灣中央研究院原子與分子科學研究所做博士后時，聶宗秀跟隨張煥正教授研究分析大分子量顆粒的離子阱質譜。商用質譜測量顆粒的粒徑范圍一般小于10 nm，無法分析超過10 nm粒徑或100萬Dalton分子量的顆粒。而分析>10 nm、>100萬Dalton的大分子顆粒在生命科學、環境科學和材料科學領域都有重要的應用。在導師指導下，聶宗秀和導師設計了特殊的離子阱質譜，通過對完整顆粒的電離測量，可以研究單個完整的細胞、細菌和病毒。
在臺灣還因為另一個課題接觸了MALDI，但發現當時MALDI都是分析蛋白，沒辦法分析小分子。2007年聶宗秀到普渡大學Graham Cooks教授實驗室從事博士后研究，主要工作是搭建一臺離子軟著陸質譜儀及一些小型化質譜。軟著陸質譜儀可使粒子帶電后，軟軟地著陸在一個表面上，離子不會碎裂。2009年聶宗秀到中科院化學所后繼續開展顆粒質譜儀和MALDI的研究工作。
帶著以前的疑問，聶宗秀開始對MALDI深入研究。第一個興趣點是：MALDI顯然是高通量的方法，但目前主要用于分析檢測蛋白質等大分子，因為在MALDI分析小分子時常存在嚴重的基質干擾，因此這種高通量的方法無法有效分析小分子，有人甚至說“用高通量的MALDI分析小分子是高射炮打蚊子”。聶宗秀卻認為，用MALDI高通量分析小分子大有可為。這是因為，尋找癌癥的生物標志物方法有三個層次，首先是尋找變異基因，其次是用蛋白質組學方法。而第三個層次是：蛋白質組學變化后，其小分子代謝物也進一步發生變化，這就是代謝組學的研究層次。代謝物都是小分子，所以課題組想從小分子的角度研究癌癥的早期發展和代謝標志物。用MALDI做代謝組學分析時面臨的一大難題就是沒有合適的小分子基質。聶宗秀課題組2012年發表多篇文章，介紹其發現的適合于小分子分析的MALDI新基質。迄今，課題組已發展了十余種小分子新基質，這些成果為第二步研究——高通量質譜成像奠定了工作基礎。
質譜成像：無標記多組分 知其然并知其所以然
首先，聶宗秀為我們普及了一些質譜成像的背景知識。
1997年，范德堡大學（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等首次報道質譜成像的工作。成像的方法很多，應用最廣泛的是得過Nobel獎的熒光成像。熒光的優點是靈敏度非常高，但需要標記，通過跟蹤標記分子來間接測量目標物。如果標記分子脫落，可能會對結果造成錯判或誤判。質譜成像最大的優點就是免標記，另一大優點是多組分同時測量，第三個優點是“知其然并知其所以然”，這是其它任何技術都做不到的。每個分子都有一個特異性指標即分子量，質譜在獲得成像的同時，測定了成像區域各分子的分子量，并可通過碎片譜MS/MS獲得更多豐富的結構信息。
打個比方來說，照片反映了光的強弱，是光在二維空間的分布；而質譜成像反映了物質的強弱，是物質在二維空間的分布。迄今化學家合成了2300多萬種物質，用質譜成像可以區分各種不同物質的分布，這是“知其然并知其所以然”，哪些區域成像強度高，是什么分子造成的，都能分析得清清楚楚。
自Caprioli第一個報道質譜成像后，成像技術發展很快，包括：MALDI成像、DESI成像、SIMS（二次離子）成像，三種方式各有其優缺點。其中，分辨率最高的是SIMS，空間分辨率可達幾十納米量級，但離子束能量高、離子源太“硬”，較難得到完整的分子離子峰。DESI的好處是可在常壓下操作，比較容易實驗，但空間分辨率在100μm以上。MALDI正好介于兩者之間，分辨率1-10μm。“除了分辨率和離子源性能的考慮，我們想做組織成像，看組織分布MALDI最合適，而且今后在醫院臨床，我認為組織成像最有前途的也是MALDI技術。”聶宗秀說，“國內有很多優秀學者開展質譜成像研究，取得了非常好的研究結果。總的來說，這三種技術相互配合，離開哪個都不行。”
課題組的MALDI成像工作
“我們在質譜成像方面開展的研究工作，在我回到中科院化學所之后開始的，“主要是兩方面工作，發展新基質，及質譜成像。由于我們有做顆粒質譜的背景，才有用MALDI成像技術分析病毒、細胞、細菌，或更小的顆粒如納米材料的想法。”
納米材料廣泛應用于組織工程學、生物等各種領域，這為分析化學工作者提供一個契機。材料學家合成很厲害，但他們迫切需要了解材料在體內的分布和其毒性，就會同分析化學家合作。以前，用質譜研究納米材料的分布很難。首先，納米材料的質量范圍超出了商用儀器的研究范圍；其次體內很多內源性小分子會干擾納米材料的測定；第三點是生物體內環境很復雜，納米材料解吸附、電離比較困難。當時課題組參加了萬立駿院士的項目就是做質譜成像；購置了布魯克公司的ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF高通量MALDI質譜儀，目標就是做納米材料的質譜成像。
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質譜儀
首先，我們發現用激光濺射碳納米管時，小分子區域中有很多貌似像雜峰的指紋峰，查了很多文獻，都認為它們來自于樣品雜質，或來自不干凈的腔體表面。但進一步研究發現，這些峰重復性很好，非常奇怪，就想把這事搞清楚。我們嘗試很多方法進一步凈化樣品，把腔體也擦得干干凈凈，但仍有這些峰；因此懷疑它們來源于樣品本身。最后通過仔細研究發現，這是m/z 12、24、36、48的一組峰，每個峰間質量數正好差12，是碳的原子量，因此這組峰是碳材料本身的團簇離子質譜峰。我們就巧妙地將高質量數窗口移到低質量窗口，解決了碳納米材料的探測的問題。
第二問題是如何解決內源性小分子干擾的問題。我們發現，改變激光波長比如當選擇355 nm的紫外激光時沒有干擾，這是因為內源性小分子對355 nm激光吸收不多。我們把碳納米管通過小鼠尾經脈注入其體內后，用355 nm激光進行質譜成像，得到同純材料非常類似的模式（Pattern）。因此選擇合適的激光波長可解決內源性小分子干擾問題，我們成功建立了納米材料在體內成像的方法。突破了上述幾大難點后，以后的定量、研究納米材料分布、在亞器官的分布就獲得了較好的實驗的結果。該工作很快被《Nature Nanotechnology》接受。
小鼠肺組織切片MoS2納米片的LDI MS成像
納米材料可用作藥物載體，我們最近用質譜成像技術研究納米載體藥物的釋放。我們選擇硫化鉬納米材料，觀察硫化鉬的信號即可得到納米材料在體內的分布。選擇的藥物是紫杉醇，觀察其信號可得到藥物在體內的分布。我們用質譜成像發現了一個有趣的現象：一般人認為腫瘤里面的材料多，但通過質譜成像發現，腫瘤里的材料很少，正常組織中材料多；腫瘤組織里面藥物釋放多，正常組織藥物釋放少，與人們想象的結果相反。
小鼠經24小時靜脈注射后肝臟組織中MoS2納米片的分布及其有效抗癌藥物DOX的原位H22腫瘤模型圖像
對質譜成像生產廠家的建議
對當前臨床所用MALDI-TOF微生物質譜，聶宗秀認為從質譜技術上來看，這些都是線性模式TOF，可以說是相對比較簡單的一種TOF。前一陣子有十幾家國內廠家都紛紛推出微生物檢測MALDI-TOF，表明技術上并無太高的門檻，聶宗秀表達了自己隱隱的擔心：過多廠商蜂擁而上會造成惡性低價競爭，最終影響產品質量。
目前反射模式的高分辨MALDI-TOF和高分辨MALDI TOF/TOF，尤其是適合高通量質譜成像研究的質譜，還只有少數廠家可以提供。從用戶角度，聶宗秀對MALDI質譜成像廠家提出三點建議。首先，TOF為獲得超高分辨率，需要很強的電場，除了加很高的電壓外，縮小了靶板與地之間的距離，希望在做高分辨時，兼顧質譜分辨率與用戶需求，盡可能增加靶板與地的空間距離。其次在做成像時，激光打靶的時間很長，打出的是等離子體，而等離子體慢慢會導電，影響高壓的壽命及穩定性而進一步影響質譜的穩定性，希望在技術上加以改進； 第三，現在商用激光器的激光波長都設在355 nm處，希望開發激光波長可調的質譜儀。
課題組研發的質譜技術
除了使用商品化質譜做應用，聶宗秀課題組也研發了一些產業化前期的質譜。比如便攜式顆粒質譜儀，以及采用二次流技術的基質噴霧儀。關于基質噴霧儀，聶老師介紹了其原理。
基質在組織切片上分布的均勻度、結晶度和晶體顆粒的大小等因素是決定質譜成像質量的關鍵因素之一。目前，MALDI（基質輔助激光解吸電離）質譜成像研究中常用的基質附著方法是采用商業化、非常昂貴的基質二次流沉積設備來進行，二次流方法使用氣流（一次流）產生的小液滴（二次流），液滴大小難于控制、尺寸不均會影響分辨率。進行質譜成像希望的理想情況是：一個分子外面包裹一層薄薄的單分子層的基質，噴霧越均勻，基質層越薄成像效果就越好。課題組使用了一臺價格低于5美元的迷你加濕器，采用超聲噴霧方法，研發了超聲噴霧儀，通過精確控制超聲波的頻率即可得到均勻大小的顆粒，改變頻率可調節顆粒尺寸，頻率越高顆粒尺寸越小。該設備提供了更高的靈敏度和更小的基質晶體（直徑小于10 μm），可獲得10μm空間分辨率的高質量離子圖像。事實證明，超聲噴霧的方法靈敏度和成像質量都得到大幅提高。課題組用MALDI-MS/MS成像以分離小鼠腦中的兩種脂質。
人物簡介：
聶宗秀，中科院化學所研究員，國家杰出青年基金獲得者。以顆粒質譜構建及小分子代謝產物質譜為主要研究方向，針對質譜在顆粒分析存在的關鍵科學與技術問題，在質譜儀器構建及應用等方面進行了系統探索研究。設計研制了多種顆粒離子化源及電荷探測器，構建了離子阱顆粒質譜裝置平臺，對微納尺度顆粒進行了多參數表征；建立了基于指紋質譜的顆粒分析方法，獲得了納米顆粒的生物組織質譜成像，將質譜質量范圍拓寬了8個數量級，從分子質譜的10e6 Da至顆粒的10e14 Da；合成和發現了系列MALDI新基質，獲得了多種動物模型下的代謝小分子質譜成像。獨立工作以來，發表通訊作者論文62篇，其中包括1篇Nature Nanotech.、1篇Science Adv.、17篇Anal. Chem.、6篇Chem. Commu.、2篇Chem. Eur. J. 。發表在Nature Nanotech.上的工作，由雜志社撰文在同期的“新聞視角”中進行了專欄評論，被Chem. Res. Toxicol.選為“研究亮點”，入選2016年Nature Nanotech.雜志10周年專刊。授權中國發明專利21項。
